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Improving the thermophilic helicase-dependant amplification by protein engineering

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Ingénierie des protéines ADN Fusion de protéines ARN polymérase I Amplification dépendante d'hélicase Hélicase Protéine de liaison à l'ADN Biologie moléculaire Thèses et écrits académiques Polymérase ADN hélicase

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Amélioration de l'amplification dépendante d'hélicase par ingénierie des protéines

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Amélioration de l'amplification dépendante d'hélicase par ingénierie des protéines

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The Helicase-Dependant Amplification (HDA) is a recent isothermal nucleic acid amplification technology based on the capacity of a helicase to unwind double-stranded DNA structures and a DNA polymerase to extend primers, for the amplification of a specific target sequence at a constant temperature. Currently, the thermophilic version (tHDA) uses Thermoanaerobacter tengcongensis UvrD helicase (TteUvrD) and Bacillus stearothermophilus DNA polymerase I Large Fragment (Bstpol) for the amplification of a DNA fragment of less than 200 bp in 90 min at 65ºC. In order to improve tHDA performance, TteUvrD and Bstpol were modified by protein engineering using the following two approaches. The first approach consisted of improving the enzymes coordination by engineering a new bifunctional protein named helimerase . Helimerases are noncovalent complexes formed by two fusion proteins, where the helicase and the polymerase were each fused to one of the coiled-coil domains for the dimerization. The results obtained from tHDA reactions using engineered proteins or helimerases revealed the importance of the enzyme coordination in the amplification of long amplicons, since only helimerase enzymes were able to perform amplification on very long amplicons, up to 2.3 kb (Motre et al. 2008). In addition, the two helimerases that differ by the nature of one of the tags showed a significant improvement in the fusion proteins solubility, thermostability and specific activity in the complex. The second approach consisted of modifying each enzyme separately, using specific mutations or fusions with DNA-binding proteins. It appeared that the efficiency of the helicase and the polymerase in tHDA were both significantly improved by the addition of Sso7d, a double-stranded DNA-binding protein from Sulfolobus solfataricus. Finally, analysis of the different constructions designed in this project permitted the understanding of the key factors of the DNA amplification in the tHDA reaction, which may benefit future researches L'amplification dépendante d'hélicase (HDA) est une nouvelle technologie d'amplification d'acide nucléique basée sur la capacité des hélicases à dérouler les doubles brins d ADN et des polymérases à synthétiser l'ADN complémentaire à partir d'amorces, pour l'amplification d'une séquence spécifique à température constante. La version thermophile utilisée actuellement (tHDA) nécessite l'hélicase UvrD de Thermoanaerobacter tengcongensis (TteUvrD) et le grand fragment de la polymérase I de Bacillus stearothermophilus (Bstpol) pour l'amplification d'un fragment d ADN de moins de 200 pb en 90 min à 65ºC. Dans le but d améliorer les performances de la tHDA, TteUvrD et Bstpol ont été modifiées par ingénierie des protéines suivant deux approches. La première approche visait à améliorer la coordination des enzymes en concevant une nouvelle protéine bifonctionnelle ou hélimérase. Les hélimérases sont des complexes non-covalents de deux protéines de fusions, dans lesquelles hélicase et polymérase sont chacune fusionnées à un des deux domaines d'une superhélice pour leur dimérisation. Les résultats obtenus en tHDA avec les protéines de fusion ou les hélimérases ont révélé l'importance de la coordination des enzymes pour l'amplification de longs fragments d ADN : seules les enzymes du complexe hélimérase sont capables d'amplifier de très longs amplicons, jusqu à 2.3 kb (Motre et al. 2008). De plus, les deux hélimérases, qui diffèrent par la nature d une des étiquettes, ont toutes deux montré l'amélioration de la solubilité, thermostabilité et activité spécifique des protéines de fusion dans le complexe. La seconde approche consistait à modifier chaque enzyme séparément, par mutation spécifique ou fusion avec des protéines qui se lient à l'ADN. Il semble que l'efficacité de l'hélicase et de la polymérase en tHDA ont toutes deux été significativement amélioré par l'addition de Sso7d, une protéine de liaison à l'ADN double brin de Sulfolobus solfataricus. Enfin, l'analyse des différentes constructions présentées dans cette étude a permis la découverte des facteurs clés de l'amplification d ADN dans les réactions tHDA, dont pourront bénéficier de futures recherches

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Text

n22:P1001

n23:T1009

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2009

rdau:P60049

n21:1020