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| - The anthracycline daunorubicin (DNR) is widely used in the treatment of many neoplastic diseases. DNR cytotoxicity was believed to be the result of drug-induced DNA damage. However, it is now established that the DNR can kill cells as a form of programmed cell death apopotis by activating a metabolic pathway. The nature of the signaling pathway(s) which initiates DNR-triggered apoptois is surely of fundamental importance in determining the chemosensitivity of the tumor cell. Indeed, the DNR activates an apoptotic signaling pathway called \"sphingomyelin cycle\". This pathway involves the hydrolysis of sphingomyelin (SM) by neutral sphingomyelinase (nSMase) and generation of ceramide (Cer). The Cer lipid messenger activates JNK/AP-1 module by mechanism depending on radical oxygen species. Hence, logically, the absence of Cer generation was responsible for resistance to apoptosis. We first proposed the involvement of a 'classic' sphingolipid pathway in DNR-triggered apoptosis, implicating raft-recruitment of p53/56 Lyn. We later observed that two Cer metabolites glucosylceramide and galactosylceramide (GalCer) could be the fundamental pro- and anti-apoptotic lipid mediators, therefore questioning the direct role of Cer. In this study, we elected to take a closer look at one of these potential cell death mediators GalCer. We report that increasing GalCer (approx. 2-fold) by overexpressing UDP-galactose-ceramide galactosyltransferase (GCT), in HEK293T and HeLa cells blocked DNR-induced apoptosis. Moreover, the increase in GalCer was essentially sequestered in plasma membrane. Indeed, raft disruption significantly inhibited galactosylceramide's inhibitory effect. We also provide evidence that caveolae are the membrane components implicated. In conclusion, we discuss how the regulation of daunorubicin-triggered apoptosis is mediated by a signaling pathway which negatively regulates p53/56 Lyn raft-recruitment, and is initiated post early sphingomyelin-derived ceramide production, and that the conversion of ceramide to galatosylceramide is an essential negative regulatory element of cell death.
- La daunorubicine (DNR) est une anthracycline largement utilisée dans le traitement du cancer. Bien que pendant longtemps, on ait considéré que la cytotoxicité de la DNR était essentiellement due aux dommages induits à l'ADN, il est maintenant établi que la DNR peut tuer les cellules selon une modalité de mort programmée, l'apoptose, en activant une voie métabolique. La nature de(s) voie(s) de signalisation impliquée(s) dans l'initiation de l'apoptose induite par la DNR est importante pour la détermination de la chimiosensibilité des cellules tumorales. En effet, la DNR active une voie de signalisation apoptotique nommée \" cycle de la sphingomyéline \". Cette voie consiste en l'hydrolyse de la sphingomyéline (SM) par la sphingomyélinase neutre (nSMase) et la génération du céramide (Cer). Le Cer généré a été décrit comme un médiateur lipidique qui induit l'apoptose en activant la voie JNK/AP-1 par un mécanisme dépendant des radicaux libres oxygénés (RLOs). Ainsi, logiquement, l'absence de la génération du Cer a été corrélée à la résistance à l'apoptose. Notre équipe a proposé que la voie classique de la synthèse des sphingolipides (SLs) participe à l'apoptose induite par la DNR, impliquant le recrutement de la protéine p53/p56 Lyn au niveau des rafts. Plus tard, il a été observé que les deux métabolites du Cer, le glucosylcéramide (GlcCer) et le galactosylcéramide (GalCer) pourraient être des médiateurs lipidiques pro- et anti-apoptotiques mettant en question le rôle direct du Cer. Dans cette étude, nous avons choisi d'analyser de plus près le rôle d'un de ces médiateurs (le GalCer) dans la réponse des cellules à la mort induite par la DNR. Nous démontrons que l'augmentation du taux intracellulaire de GalCer (environ 2 fois), par la surexpression de l'UDP-galactose galactosylcéramide transférase (GCT), induit la résistance des cellules HEK293T et Hela à l'apoptose induite par la DNR. Par ailleurs, nous démontrons que le GalCer est essentiellement séquestré à la membrane plasmique, en particulier dans les microdomaines membranaires \" rafts \". En effet, la perturbation des rafts enrichis en GalCer sensibilise les cellules HEK-GCT et Hela-GCT à l'apoptose induite par la DNR. Ensuite, nous démontrons que le GalCer est concentré dans des structures particulières des rafts, les cavéoles. Enfin, nous démontrons l'implication du GalCer dans l'inhibition de la translocation de la protéine p53/p56 Lyn au niveau des rafts. En conclusion, nous proposons que l'apoptose induite par la DNR est modulée par une voie de signalisation qui régule négativement la translocation de Lyn au niveau des rafts, et que la conversion du Cer en GalCer est un élément essentiel de la régulation négative de la mort cellulaire.
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