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| - De récentes avancées technologiques ont révélé que des petits ORF (Open Reading Frame), dont la taille est inférieure à 100 codons et qui étaient jusqu'à présent considérés comme non codants à cause de leur petite taille, peuvent être traduits en des milliers de petits peptides smORF (small ORF) dans tous les organismes. Plusieurs études ont montré que des peptides smORF peuvent interagir avec des protéines canoniques et réguler leur activité. La famille des peptides smORF représente ainsi un réservoir largement inexploré de potentiels régulateurs. Un crible fonctionnel mené chez la Drosophile nous a permis d'identifier de nouveaux peptides smORF impliqués dans le développement, dont plusieurs sont issus de la traduction d'ARN polycistroniques. Mon projet de recherche de thèse a été de caractériser la fonction chez la Drosophile de 1) Tic et Tac, deux peptides smORF inconnus codés par un ARN bicistronique , et de 2) Sem1/DSS1, un peptide très conservé. La première partie de mes travaux de thèse a été d'analyser la fonction biologique de deux peptides smORF inconnus codés par un ARN bicistronique que nous avons nommé tictac. J'ai démontré que Tic et Tac sont deux peptides traduits à partir du même ARN bicistronique tictac, dont la séquence en AA et la localisation cellulaire sont différentes. In vivo, tictac est fortement exprimé dans les organes reproducteurs mâles. A la suite d'un accouplement, les changements comportementaux et physiologiques caractérisant la réponse post-accouplement de la femelle, induits par le fluide séminal, sont affectés en absence de tictac chez les mâles. Grâce à l'analyse du transcriptome sur les organes reproducteurs mâles, je montre que l'absence de tictac conduit à une dérégulation transcriptionnelle de 150 gènes, dont 10% codent pour des composants du liquide séminal, montrant que tictac régule sa composition. La délétion spécifique de tic ou de tac, montre qu'ils ont des fonctions in vivo différentes mais que tous deux sont impliqués dans la synthèse du liquide séminal. L'analyse des glandes accessoires, l'organe fonctionnel équivalent de la prostate humaine fabriquant le fluide séminal, révèle que leur maturation et que leur fonction sécrétrice sont régulées par tictac. La recherche d'homologues de Tic et de Tac indique que Tic possède un domaine peptidique présentant une homologie avec un sous-domaine de RQC1 de levure, impliquée dans le contrôle qualité des ribosomes, alors que Tac possède un domaine serglycine, connu chez l'homme pour avoir des fonctions importantes dans la sécrétion. Ainsi, les peptides smORF Tic et Tac contribueraient à la synthèse et à la sécrétion des protéines du fluide séminal. Dans un second temps, j'ai mené l'analyse moléculaire de Sem1, une protéine intrinsèquement désordonnée connue pour interagir et réguler plusieurs complexes macromoléculaires. Comme ces données ont été générées dans des modèles in cellulo et in vitro, j'ai mené l'analyse moléculaire de Sem1 pour la première fois in vivo. J'ai montré que Sem1 est essentielle car sa délétion induit une létalité au stade larvaire. De plus, son absence entraine une apoptose massive se généralisant à l'ensemble du tissu de manière non-cellulaire autonome. Pour découpler les fonctions moléculaires de Sem1 et identifier le(s) domaine(s) protéique(s) essentiels à la survie cellulaire, j'ai généré pour chaque domaine fonctionnel une forme mutée, dont j'ai induit l'expression dans un contexte déplété de Sem1. Cette analyse structure-fonction met en évidence que les deux domaines interagissant avec l'ubiquitine sont essentiels au développement. En conclusion, mes travaux de thèse mettent en lumière de nouvelles fonctions des peptides smORF dans la reproduction et la survie cellulaire, illustrant la capacité des peptides smORF à agir sur de multiples complexes macro-moléculaires et contrôler ainsi de nombreux processus physiologiques.
- Recent technological advances have revealed that small ORFs (Open Reading Frame), which are less than 100 codons in size and were previously considered non-coding due to their small size, can be translated into thousands of smORF (small ORF) peptides in all organisms. Several studies have shown that smORF peptides can interact with canonical proteins and regulate their activity. Thus, the smORF peptide family represents a vast unexplored reservoir of potential regulators. A functional screen carried out in Drosophila identified new smORF peptides involved in development, several of which are derived from polycistronic RNA translation. My thesis research project was to characterize the function in Drosophila of 1) Tic and Tac, two unknown smORF peptides encoded by a bicistronic RNA, and 2) Sem1/DSS1, a highly conserved peptide. The first part of my thesis was to analyze the biological function of two unknown smORF peptides encoded by a bicistronic RNA that we named tictac. I demonstrated that Tic and Tac are two peptides translated from the same bicistronic RNA tictac, but with different AA sequences and cellular localization. In vivo, tictac is highly expressed in male reproductive organs. Following mating, behavioral and physiological changes characterizing the post-mating response in female, which are mainly induced by the seminal fluid, are affected in the absence of tictac in males. Using transcriptome analysis on male reproductive organs, I show that the absence of tictac leads to transcriptional deregulation of 150 genes. Among them, 10% code for seminal fluid components, proving that tictac regulates its composition. Specific deletion of either tic or tac highlights that they have different in vivo functions, but that both are involved in seminal fluid synthesis. The analysis of accessory glands, the functional seminal fluid-producing organ equivalent to the human prostate, reveals that their maturation and secretory function are regulated by tictac. The search for homologs of Tic and Tac indicates that Tic has a peptide domain with strong homology to a subdomain of RQC1, a yeast protein involved in ribosome quality control, and Tac has a serglycin domain, known in human to have important functions in secretion. My data therefore suggests that Tic and Tac smORF peptides may contribute to the synthesis and secretion of seminal fluid proteins. In a second step, I carried out the molecular analysis of Sem1, an intrinsically disordered protein known to interact with and regulate several macromolecular complexes. As these data were only generated in cellulo and in vitro models, I carried out the molecular analysis of Sem1 for the first time in vivo. I showed that Sem1 is essential, as its deletion induces lethality at the larval stage. Moreover, its absence leads to massive apoptosis that generalizes to the whole tissue in a non-cell-autonomous manner. To uncouple the molecular functions of Sem1 and identify the protein domains essential for cell survival, I generated a mutated form of each functional domain, then induced its expression in the absence of endogenous Sem1. This structure-function analysis revealed that two domains known to interact with ubiquitin are essential for development. In conclusion, my thesis work highlights new functions of smORF peptides in reproduction and cell survival, illustrating the ability of smORF peptides to act on multiple macro-molecular complexes, thus controlling numerous physiological processes.
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