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| type
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| Thesis advisor
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| Praeses
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| Author
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| alternative label
| - Regulation of the dual RNA degradation activity of RNase J by RNA epi-transcriptomic modifications and secondary structures
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| dc:subject
| - Bioinformatique
- Dégradation de l'ARN
- Thèses et écrits académiques
- Ribonucléases
- ARN messagers -- Détérioration
- ARN pyrophosphohydrolases
- Inférence des structures d'ARN
- Modifications épi-transcriptomiques
- Traitement des données NGS
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| preferred label
| - Régulation de la double activité de dégradation de l'ARN de la RNase J par les modifications épi-transcriptomiques et les structures secondaires
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| Language
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| Subject
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| dc:title
| - Régulation de la double activité de dégradation de l'ARN de la RNase J par les modifications épi-transcriptomiques et les structures secondaires
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| Degree granting institution
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| Opponent
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| note
| - Les ribonucléases permettant de dégrader et/ou maturer les ARN sont vitales pour l'adaptation de la cellule à des changements environnementaux brusques. Elles possèdent deux modes d'action, un mode endonucléolytique clivant les ARN de manière interne et un mode exonucléolytique les dégradant à partir des extrémités 5' ou 3'. Les endoribonucléases reflètent un cas remarquable d'évolution convergente car cette activité est portée par la RNase E, la RNase Y et la RNase J, protéines sans aucune similarité de séquences. Il a aussi été montré qu'en fonction des espèces bactériennes, les substrats et l'activité de ces ribonucléases pouvaient être différents, les rendant parfois essentielles à la survie de la cellule. Mes travaux de thèse portaient sur l'étude du rôle et de la régulation du complexe RNase J chez la bactérie pathogène Staphylococcus aureus. Ce complexe possède une activité duale, endo- et 5' exoribonucléolytique. Cette dernière montre une préférence pour les ARN monophosphorylés en 5' (5'P) par rapport aux ARN triphosphorylés (5'PPP). Lors de mon travail de thèse, j'ai développé des méthodes statistiques et bioinformatiques adaptées au traitement et à l'analyse de données de séquençage des extrémités 5' des ARN, données obtenues par une équipe collaboratrice ayant développé des protocoles expérimentaux permettant d'étudier in vivo et à l'échelle du génome l'activité du complexe RNase J. Ces développements ont été regroupés au sein d'une librairie R libre et gratuite. La première question abordée a été l'identification de la ou des protéines NUDIX ribopyrophosphohydrolases (RppH) responsables de la conversion des ARN 5'PPP en 5'P en vue de leur dégradation par le complexe RNase J. Parmi les cinq RppH prédites in silico chez S. aureus, seule l'étude de la plus similaire à celle de B. subtilis a été publiée concluant à son faible impact sur la stabilité des ARN. Mes travaux ont permis de valider le protocole expérimental par rapport à sa capacité à traduire les abondances en proportions des états de phosphorylation de chaque ARN afin de déterminer statistiquement des différences de proportions. Des mutants de délétion pour les cinq RppH candidates (délétions seules ou combinées) ont été obtenus. Aucun des mutants étudiés n'a perdu totalement l'activité RppH. Le système de régulation de ce mécanisme se révèle donc plus complexe qu'attendu chez S. aureus et la difficulté d'obtention de certains mutants de délétion suggère un mécanisme particulier dans cet organisme. En parallèle, j'ai exploité des données RNA-Seq déjà disponibles obtenues en bloquant la transcription et en mesurant l'abondance des ARN au cours du temps par analyses transcriptomiques, entre une souche S. aureus sauvage et une souche DELTARNase J. En comparant la stabilité des ARN, j'ai montré que 47% des gènes avaient des ARN dont la dégradation dépend de cette enzyme, avec une préférence pour les gènes fortement exprimés. J'ai également réalisé l'analyse quantitative des intermédiaires de dégradation par rapport aux cadres ouverts de lecture, obtenus grâce à une autre méthode de quantification in vivo des extrémités 5' des ARN. J'ai mis en évidence, dans la souche sauvage, une distribution périodique de 3 nucléotides correspondant aux codons qui n'est quasiment plus observée dans le mutant DELTARNase J. J'ai ainsi montré que la RNase J peut suivre le dernier ribosome en cours de traduction et qu'elle serait un acteur majeur du mécanisme de dégradation co-traductionnelle. D'autres analyses de ces mêmes données m'ont permis de prédire 125 sites de clivages endoribonucléolytiques de la RNase J. Ces résultats préliminaires pourront servir de point de départ pour des études complémentaires.
- Ribonucleases responsible of RNA degradation and/or maturation are vital for the cell's adaptation to sudden environmental changes. They have two modes of action, an endonucleolytic mode cleaving RNAs internally, and an exonucleolytic mode degrading them from their 5' or 3' ends. Endoribonucleases reflect a remarkable case of convergent evolution, as this activity is carried by RNase E, RNase Y and RNase J, proteins with no sequence similarity. It has also been shown that, depending on the bacterial species, the substrates and activity of these ribonucleases can differ, making them sometimes essential for cell survival. My thesis work focused on the role and regulation of the RNase J complex in the pathogenic bacteria Staphylococcus aureus. This complex has dual endo- and 5' exoribonucleolytic activity. The latter shows a preference for 5' monophosphorylated RNAs (5'P) over triphosphorylated RNAs (5'PPP). During my thesis work, I developed statistical and bioinformatics methods adapted to the processing and analysis of RNA 5'-end sequencing data obtained by a collaborating team who had developed experimental protocols to study the activity of the RNase J complex in vivo and on a genome-wide scale. These developments have been integrated into an open-source R package accessible on the CNRS GitLab instance. The first question addressed was the identification of the NUDIX ribopyrophosphohydrolase (RppH) protein(s) responsible for converting 5'PPP RNAs to 5'P for degradation by the RNase J complex. Of the five RppHs predicted in silico in S. aureus, only the one most similar to that of B. subtilis has been published, concluding that it has little impact on RNA stability. My work has validated the experimental protocol in terms of its ability to translate abundances into proportions of the phosphorylation states of each RNA in order to statistically identify differences in proportions. Deletion mutants for the five RppH candidates (single or combined deletions) were obtained. None of the mutants studied totally lost RppH activity. The regulatory system for this mechanism is therefore more complex than expected in S. aureus, and the difficulty to obtain certain deletion mutants suggests a particular mechanism in this organism. In parallel, I exploited previously available RNA-Seq data obtained by blocking transcription and measuring RNA abundance over time by transcriptomic analyses, between a wild-type S. aureus strain and a DELTARNase J strain. By comparing RNA stability, I showed that 47% of genes had RNAs whose degradation depended on this enzyme, with a preference for highly expressed genes. I also carried out a quantitative analysis of degradation intermediates relative to open reading frames, obtained using another method for in vivo quantification of RNA 5' ends. In the wild-type strain, I highlighted a periodic distribution of 3 nucleotides corresponding to codons, which is practically no longer observed in the DELTARNase J mutant. I thus demonstrated that RNase J can follow the last ribosome during translation, and that it is a major player in the co-translational degradation mechanism. Further analysis of the same data enabled me to predict 125 endoribonucleolytic cleavage sites for RNase J. These preliminary results may serve as a starting point for further studies. My work as a whole has therefore provided new information on the in vivo activity and role of the RNase J complex in S. aureus, and the methods I have developed dedicated to the analysis of 5' RNA-Seq data may be used in other studies of this type.
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| http://iflastandar...bd/elements/P1001
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| rdaw:P10219
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