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The molecular aspects of RecQ helicase family

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Adhésines d'Escherichia coli Arginine Ions zinc Thèses et écrits académiques Helicase Bacillus subtilis

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Aspects moléculaires des hélicases de la famille de RecQ

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Aspects moléculaires des hélicases de la famille de RecQ

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In the cells, the unwinding of double-stranded polynucleotides is catalyzed by helicases that exist in all kingdoms of life from virus to human. RecQ family helicases play essential roles in nucleic acid metabolism by facilitating cellular processes including genome replication, DNA repair, recombination, transcription and telomere maintenance. In human, five RecQ family members named RECQ1, BLM, WRN, RECQ4 and RECQ5, have been identified. Defects in BLM, WRN and RECQ4 will give rise to autosomal recessive disorders and predisposition to cancer. In addition to the highly conserved helicase core domain containing seven helicase motifs, most RecQ family helicases have a unique RecQ C-terminal domain (RecQ-Ct) and the Helicase RNase D conserved domain (HRDC). In the present studies, we focus on the intra-functional mechanisms of some important members of RecQ family helicases. Firstly, we have chosen two natural isoforms of human RECQ5 helicase as models to study the functional modulation of the helicase core domain by the zinc-binding domain. Here we show that a truncated variant of the human RECQ5β helicase comprised of the conserved helicase domain only, a splice variant named RECQ5α, possesses neither ATPase nor DNA unwinding activities, but surprisingly displays a strong strand annealing activity. Quantitative measurements indicate that the regulatory role of the zinc-binding motif of RECQ5β is achieved by enhancing the DNA binding affinity of the helicase. More important, the zinc-binding motif of RECQ5β is found to act as a molecular switch that suppresses the strand-annealing activity of the helicase domain and triggers DNAunwinding activity of the enzyme through enhancing DNA binding. Subsequently, we analyzed the biochemical properties of two isoforms of Bacillus subtilis RecQ helicases: SubL and SubS. Between them, SubS naturally lacks the HRDC domain. Our studies demonstrate that the HRDC domain is crucial in Bacillus subtilis RecQ helicases in unwinding of DNA replication/repair intermediates such as Holliday junction and kappa junction. The enzyme with HRDC domain shows stronger ATPase activity and DNA unwinding and annealing activities than the other one. These results allow us to speculate on the importance of HRDC domain in the basic activities of RecQ family helicases. In the last part, we investigated the existence and role of the arginine finger in the Bloom syndrome protein (BLM) in ATP hydrolysis and energy coupling. Our studies demonstrate that R982 is the residue located near the γ-phosphate of ATP which functions as a BLM 14 arginine finger. Our finding further indicates that the arginine finger interacts with other conserved motifs around γ-phosphate of the nucleotide to carry out the functions as a complex network. Dans les cellules, le déroulement de l’ADN double-brin est catalysé par une famille de protéines appelées hélicases. Ces protéines sont présentes chez tous les organismes des virus jusqu’à l'homme. Parmi ces hélicases, celles de la famille RecQ jouent un rôle essentiel dans le métabolisme de l’ADN en facilitant de nombreux processus cellulaires tels que la réplication, la réparation, la recombinaison, la transcription et la maintenance des télomères. Chez l'homme, il existe cinq membres de la famille RecQ identifiés comme RECQ1, BLM, WRN, RECQ4 et RECQ5. Les mutations dans BLM, WRN et RECQ4 sont associées à une prédisposition au cancer. En plus du domaine hélicase très conservé et contenant sept motifs bien distincts, la plupart des hélicases de la famille RecQ possèdent également un domaine RecQ C-terminal (RecQ-Ct) et un domaine hélicase RNase D (HRDC). Au cours de ce travail, nous nous concentrons sur les mécanismes intrafonctionnels de certains membres de la famille RecQ des hélicases. Tout d'abord, nous avons utilisé deux isoformes naturels de l’hélicase RECQ5 humain comme modèle pour étudier la modulation fonctionnelle du domaine hélicase avec le doigt de zinc. Ici, nous montrons que la variante tronquée RECQ5α de l’hélicase RECQ5β issue d’un épissage alternatif et composée uniquement du domaine hélicase ne possède ni l’activité ATPase ni l’activité de déroulement de l’ADN. A l’inverse, et ce de matière étonnante, cette protéine est dotée d’une forte activité de réhybridation du brin déroulé. Les mesures quantitatives indiquent que l’amélioration de l’affinité de la protéine pour l’ADN que lui confère le doigt de zinc est à l’origine de ses activités ATPase et hélicase. Le plus important est que l’on constate que le doigt de zinc est capable d'agir comme un facteur moléculaire à même de supprimer l'activité de re-synthèse du brin déroulé par le domaine hélicase et de déclencher l’activité de déroulement d'ADN à travers une modulation de la fixation à l’ADN. Ensuite, nous avons analysé les propriétés biochimiques de deux isoformes de l’hélicase RecQ de Bacillus subtilis : SubL et SubS. Parmi elles, SubS ne dispose pas du domaine HRDC. Nos études montrent que le domaine HRDC est crucial pour Bacillus subtilis RecQ hélicases dans la résolution des intermédiaires de réplication et / ou de réparation de l'ADN tels que les jonctions de Holliday et la jonction de kappa. Les activités ATPase, hélicase et l'activité de rehybridation du brin déroulé sont plus importantes en présence du domaine HRDC. Ces résultats nous permettent de spéculer sur l'importance du domaine HRDC des activités de la famille de RecQ hélicase. Nous avons découvert que dans la famille RecQ, le 12 domaine HRDC peut augmenter les activités ATPases et hélicases. De manière intéressante, le domaine HRDC de Bacillus subtilis joue un rôle critique dans la résolution des intermédiaires de réplication ou de réparation de l'ADN et des jonctions de Holliday. Nous suggérons l'hypothèse que le domaine HRDC des hélicases RecQ participe à exposer leurs fonctions dans le processus de réparation de l'ADN. Dans la dernière partie, nous nous sommes intéressés à l'existence et au rôle du doigt d'arginine dans la protéine BLM. Ces études ont été menées afin de démontrer son rôle dans l'hydrolyse d'ATP et dans la conversion en mouvement mécanique permettant à la protéine de progresser le long de l’ADN. Nos études démontrent que le résidu R982, situé à proximité du γ-phosphate de l'ATP, fonctionne comme un doigt d’arginine dans la protéine BLM. Nos conclusions indiquent en outre que ce doigt d’arginine interagit avec d'autres motifs conservés situés autour du γ-phosphate des nucléotides et qu’ils effectuent ensemble les fonctions enzymatiques au sein d’un réseau complexe.

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Text

n13:P1001

n14:T1009

rdaw:P10219

2009

rdau:P60049

n8:1020