. . . "Th\u00E8ses et \u00E9crits acad\u00E9miques" . . . . . "2020" . . . "Text" . . "Eucalyptus" . "Implementing the CRISPR-Cas9 technology in Eucalyptus hairy roots and functional characterization of auxin-dependent transcription factors involved in wood formation" . "Plantes -- Membrane cellulaire" . "Xyl\u00E8me" . "Lignine" . . "Implementing the CRISPR-Cas9 technology in Eucalyptus hairy roots and functional characterization of auxin-dependent transcription factors involved in wood formation" . . . . "Paroi cellulaire secondaire" . "Les Eucalyptus sont les feuillus les plus plant\u00E9s au monde pour les nombreuses utilisations industrielles de leurs bois tells que la p\u00E2te \u00E0 papier et la production \u00E9mergente de biocarburants. L'analyse du g\u00E9nome d'Eucalyptus grandis a conduit \u00E0 l'identification de nombreux candidats impliqu\u00E9s dans la formation du bois, tells que des m\u00E9diateurs cl\u00E9s de la signalization de l'auxine (Aux/IAA et Auxin Response Factor (ARF). La caract\u00E9risation fonctionnelle de ces g\u00E8nes candidats a \u00E9t\u00E9 retard\u00E9e jusqu'\u00E0 pr\u00E9sent par la difficult\u00E9 de supprimer leurs fonctions dans un syst\u00E8me homologue. Pour pallier \u00E0 cela, le premier objectif de mon travail a \u00E9t\u00E9 de mettre au point le puissant outil d'\u00E9dition de g\u00E8nes \\\"CRISPR/Cas9\\\" en profitant de la transformation de \\\"hairy roots\\\" transg\u00E9niques m\u00E9di\u00E9e par A. rhizogenes, r\u00E9cemment d\u00E9velopp\u00E9e dans l'\u00E9quipe. Dans un deuxi\u00E8me temps, mon objectif \u00E9tait d'utiliser cette m\u00E9thode d'\u00E9dition de g\u00E9nome pour \u00E9tudier les r\u00F4les potentiels de trois facteurs de transcription d\u00E9pendant de l'auxine (IAA9A, IAA20 et ARF5) dans la formation du bois d'Eucalyptus. Premi\u00E8rement, comme preuve de concept pour la mise en oeuvre de la technologie CRISPR/Cas9, nous avons cibl\u00E9 la Cinnamoyl-CoA r\u00E9ductase1 (CCR1), un g\u00E8ne cl\u00E9 de la biosynth\u00E8se de la lignine dont les effets de \\\"down-regulation\\\" sont bien connus. Nous avons \u00E9galement utilis\u00E9 le g\u00E8ne IAA9A comme cible. Presque toutes les lign\u00E9es transg\u00E9niques ont \u00E9t\u00E9 \u00E9dit\u00E9es, mais les taux et les profils d'\u00E9dition all\u00E9liques variaient consid\u00E9rablement selon le g\u00E8ne cibl\u00E9. La plupart des \u00E9v\u00E9nements d'\u00E9dition ont g\u00E9n\u00E9r\u00E9 des prot\u00E9ines tronqu\u00E9es. En utilisant une combinaison de spectroscopie \u00E0 infrarouge transform\u00E9e de Fourier (FT-IR) et d'analyse multivari\u00E9e (PLS-DA), j'ai pu montrer que les lign\u00E9es \u00E9dit\u00E9es pour CCR1, \u00E9taient clairement s\u00E9par\u00E9es des t\u00E9moins. Les analyses histochimiques ont confirm\u00E9 la diminution de la lignification et la pr\u00E9sence de vaisseaux \u00E9cras\u00E9s dans les lign\u00E9es \u00E9dit\u00E9es pour CCR1, qui sont des caract\u00E9ristiques de la d\u00E9ficience de ce g\u00E8ne. Bien que l'efficacit\u00E9 de l'\u00E9dition puisse \u00EAtre am\u00E9lior\u00E9e, la m\u00E9thode d\u00E9crite ici est d\u00E9j\u00E0 un outil utile pour caract\u00E9riser fonctionnellement des g\u00E8nes chez l'Eucalyptus. Dans la deuxi\u00E8me partie de mon travail, j'ai utilis\u00E9 cette m\u00E9thode d'\u00E9dition du g\u00E9nome pour muter deux Aux/IAAs (IAA9A et IAA20) ainsi que ARF5 afin de mieux appr\u00E9hender le r\u00F4le de l'auxine dans la r\u00E9gulation de la formation du bois chez l'Eucalyptus. J'ai g\u00E9n\u00E9r\u00E9 des \\\"hairy roots\\\" soit pour surexprimer ces g\u00E8nes, soit pour les muter par CRISPR/Cas9. Malheureusement, toutes les plantes transg\u00E9niques surexprimant IAA9A et IAA20 (sous le contr\u00F4le du promoteur CaMV35S) sont mortes pendant la p\u00E9riode de confinement li\u00E9e au Covid19 et seules trois lign\u00E9es CRISPR-IAA20 ont surv\u00E9cu. Par cons\u00E9quent, je n'ai pu analyser que des plantes transg\u00E9niques \u00E9dit\u00E9es pour deux candidats. Les lign\u00E9es IAA9A g\u00E9n\u00E9r\u00E9es par CRISPR/Cas9 pr\u00E9sentaient des taux de knock-out \u00E9lev\u00E9s de 92,3% avec 58,3% de mutations biall\u00E9liques. En revanche, les lign\u00E9es ARF5 avaient des taux d'\u00E9dition assez faibles (43%) et des mutations monoall\u00E9liques et/ou chim\u00E9riques.[...]" . "CRISPR-Cas9" . . "Eucalyptus is the most planted hardwood worldwide for many industrial end-uses such as pulp and paper and emerging biofuel production. The analysis of the Eucalyptus grandis genome led to many candidate genes involved in wood formation including key mediators of auxin signaling (Auxin/Indole-3-Acetic Acid (Aux/IAA) and Auxin Response Factor (ARF). The functional characterization of these candidate genes was hampered by the difficulty to general stable transgenic Eucalyptus and to knock out these genes. Taking advantage of rapid and efficient hairy root transformation mediated by A.rhizogenes, recently implemented by our team, the objectives of my work were to implement the powerful CRISPR/Cas9 gene editing tool and to use it to investigate the potential roles of three Eucalyptus auxin-dependent transcription factors (IAA9A, IAA20 and ARF5) in regulating wood formation. First, as a proof-of-concept for implementing CRISPR/Cas9, We targeted Cinnamoyl-CoA Reductase1 (CCR1), a key lignin biosynthetic gene whose down-regulation effects are well described in several plants. Almost all transgenic lines were edited but the allele-editing rates and profiles varied greatly depending on the genes targeted. Most edition events generated truncated proteins. The prevalent edition types were small deletions but large deletions were also observed. By using a combination of Fourier Transformed InfraRed (FT-IR) spectroscopy and multivariate analysis (partial least square analysis (PLS-DA), we showed that the CCR1-edited lines, which were clearly separated from the controls. The most discriminant wave-numbers were attributed to lignin. Histochemical analyses further confirmed the decreased lignification and the presence of collapsed vessels in CCR1-edited lines, which are characteristics of CCR1 deficiency. Although the efficiency of editing could be improved, the method described here is already a useful tool to functionally characterize eucalypts genes. In the second part of my work, we used this genome editing method to knock out two Aux/IAAs (IAA9A and IAA20) and one Auxin Response Factor (ARF5) in order to get more insights into the role of auxin in the regulation of wood formation in Eucalyptus. We generated transgenic Eucalyptus hairy root to overexpress and to knock out these genes. Unfortunately, all the transgenic plants overexpressing IAA9A and IAA20 (under the control of 35S promoter) died during the Covid19 lockdown period and only three IAA20-CRISPR lines survived. Therefore, we could only analyze CRISPR/Cas9 edited transgenic plants for two candidates (IAA9A and ARF5). Editing events were detected either by subcloning and/or webbased tools (DSDecode and ICE synthego). CRISPR/Cas9 generated IAA9A_lines had high knockout rates of 92.3% with 58.3% of biallelic mutations. In contrast, ARF5 lines had quite low editing rates (43%) showing monoallelic and chimera mutations. [...]" . "Auxin" . "Mise au point de la technologie CRISPR-Cas9 dans des racines \\\" hairy root \\\" d'Eucalyptus grandis et caract\u00E9risation fonctionnelle de facteurs de transcription de la signalisation auxinique potentiellement impliqu\u00E9s dans la formation du bois" .