. "Ing\u00E9nierie des prot\u00E9ines" . . "Improving the thermophilic helicase-dependant amplification by protein engineering" . "ADN" . "Fusion de prot\u00E9ines" . . . "ARN polym\u00E9rase I" . . "Amplification d\u00E9pendante d'h\u00E9licase" . . "Am\u00E9lioration de l'amplification d\u00E9pendante d'h\u00E9licase par ing\u00E9nierie des prot\u00E9ines" . . "Am\u00E9lioration de l'amplification d\u00E9pendante d'h\u00E9licase par ing\u00E9nierie des prot\u00E9ines" . "H\u00E9licase" . "Prot\u00E9ine de liaison \u00E0 l'ADN" . . "Biologie mol\u00E9culaire" . . . . . "Th\u00E8ses et \u00E9crits acad\u00E9miques" . "The Helicase-Dependant Amplification (HDA) is a recent isothermal nucleic acid amplification technology based on the capacity of a helicase to unwind double-stranded DNA structures and a DNA polymerase to extend primers, for the amplification of a specific target sequence at a constant temperature. Currently, the thermophilic version (tHDA) uses Thermoanaerobacter tengcongensis UvrD helicase (TteUvrD) and Bacillus stearothermophilus DNA polymerase I Large Fragment (Bstpol) for the amplification of a DNA fragment of less than 200 bp in 90 min at 65\u00BAC. In order to improve tHDA performance, TteUvrD and Bstpol were modified by protein engineering using the following two approaches. The first approach consisted of improving the enzymes coordination by engineering a new bifunctional protein named helimerase . Helimerases are noncovalent complexes formed by two fusion proteins, where the helicase and the polymerase were each fused to one of the coiled-coil domains for the dimerization. The results obtained from tHDA reactions using engineered proteins or helimerases revealed the importance of the enzyme coordination in the amplification of long amplicons, since only helimerase enzymes were able to perform amplification on very long amplicons, up to 2.3 kb (Motre et al. 2008). In addition, the two helimerases that differ by the nature of one of the tags showed a significant improvement in the fusion proteins solubility, thermostability and specific activity in the complex. The second approach consisted of modifying each enzyme separately, using specific mutations or fusions with DNA-binding proteins. It appeared that the efficiency of the helicase and the polymerase in tHDA were both significantly improved by the addition of Sso7d, a double-stranded DNA-binding protein from Sulfolobus solfataricus. Finally, analysis of the different constructions designed in this project permitted the understanding of the key factors of the DNA amplification in the tHDA reaction, which may benefit future researches" . "Polym\u00E9rase" . . "L'amplification d\u00E9pendante d'h\u00E9licase (HDA) est une nouvelle technologie d'amplification d'acide nucl\u00E9ique bas\u00E9e sur la capacit\u00E9 des h\u00E9licases \u00E0 d\u00E9rouler les doubles brins d ADN et des polym\u00E9rases \u00E0 synth\u00E9tiser l'ADN compl\u00E9mentaire \u00E0 partir d'amorces, pour l'amplification d'une s\u00E9quence sp\u00E9cifique \u00E0 temp\u00E9rature constante. La version thermophile utilis\u00E9e actuellement (tHDA) n\u00E9cessite l'h\u00E9licase UvrD de Thermoanaerobacter tengcongensis (TteUvrD) et le grand fragment de la polym\u00E9rase I de Bacillus stearothermophilus (Bstpol) pour l'amplification d'un fragment d ADN de moins de 200 pb en 90 min \u00E0 65\u00BAC. Dans le but d am\u00E9liorer les performances de la tHDA, TteUvrD et Bstpol ont \u00E9t\u00E9 modifi\u00E9es par ing\u00E9nierie des prot\u00E9ines suivant deux approches. La premi\u00E8re approche visait \u00E0 am\u00E9liorer la coordination des enzymes en concevant une nouvelle prot\u00E9ine bifonctionnelle ou h\u00E9lim\u00E9rase. Les h\u00E9lim\u00E9rases sont des complexes non-covalents de deux prot\u00E9ines de fusions, dans lesquelles h\u00E9licase et polym\u00E9rase sont chacune fusionn\u00E9es \u00E0 un des deux domaines d'une superh\u00E9lice pour leur dim\u00E9risation. Les r\u00E9sultats obtenus en tHDA avec les prot\u00E9ines de fusion ou les h\u00E9lim\u00E9rases ont r\u00E9v\u00E9l\u00E9 l'importance de la coordination des enzymes pour l'amplification de longs fragments d ADN : seules les enzymes du complexe h\u00E9lim\u00E9rase sont capables d'amplifier de tr\u00E8s longs amplicons, jusqu \u00E0 2.3 kb (Motre et al. 2008). De plus, les deux h\u00E9lim\u00E9rases, qui diff\u00E8rent par la nature d une des \u00E9tiquettes, ont toutes deux montr\u00E9 l'am\u00E9lioration de la solubilit\u00E9, thermostabilit\u00E9 et activit\u00E9 sp\u00E9cifique des prot\u00E9ines de fusion dans le complexe. La seconde approche consistait \u00E0 modifier chaque enzyme s\u00E9par\u00E9ment, par mutation sp\u00E9cifique ou fusion avec des prot\u00E9ines qui se lient \u00E0 l'ADN. Il semble que l'efficacit\u00E9 de l'h\u00E9licase et de la polym\u00E9rase en tHDA ont toutes deux \u00E9t\u00E9 significativement am\u00E9lior\u00E9 par l'addition de Sso7d, une prot\u00E9ine de liaison \u00E0 l'ADN double brin de Sulfolobus solfataricus. Enfin, l'analyse des diff\u00E9rentes constructions pr\u00E9sent\u00E9es dans cette \u00E9tude a permis la d\u00E9couverte des facteurs cl\u00E9s de l'amplification d ADN dans les r\u00E9actions tHDA, dont pourront b\u00E9n\u00E9ficier de futures recherches" . . "ADN h\u00E9licase" . "Text" . . . "2009" .